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| 1 | 慢性病毒性肝炎发病机制的分子生物学研究显示文摘由乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的感染引起的急性和慢性肝病目前还没有满意的治疗方法.新型治疗方法和治疗药物的研究开发,依赖于肝炎病毒致病的分子生物学机制的研究进展.关于HBV感染个体准种概念的引入,使我们对于HBV基因变异的研究,从单一病毒的基因变异上升到群体病毒的基因变异?从静态的基因突变上升到动态的基因变异,从而对HBV存在状态的看法发生了根本的改变.HBV感染肝细胞的相关受体蛋白虽然进行了多年的研究,但还没有最终确定.利用新型技术对于HBV表面抗原蛋白的结合蛋白进行筛选是一个重要的方向.HBV和HCV感染与肝细胞癌之间的关系已经得到确定,但是具体的分子生物学机制还有许多工作要做.研究这2种肝炎病毒反式激活作用的把基因是阐明其引起肝细胞癌分子生物学机制的重要途径.在肝细胞中表达的肝炎病毒蛋白不是孤立存在的,或者与其自身结合形成同二聚体,或者与病毒的其他蛋白?肝细胞蛋白结合形成异二聚体,从而对于肝细胞的生长?代谢?甚至是恶性转化产生重要影响. | 成军 | 2002 | 世界华人消化杂志2002，10，2： | 141 |
| 2 | 乙型肝炎病毒基因组中前-前-S区编码基因的界定显示文摘目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠,是基因组序列高度集中利用的一个典型。早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF),本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较,阐明基因组结构的特点,并探索是否存在新型ORF的可能性。方法:考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度,我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术,根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物,自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列,克隆入pGEM Teasy质粒,挑选克隆进行全基因组DNA测序,与其他HBV基因组序列进行比较。结果:测序结果5株HBV全基因组核苷酸序列存在一新的ORF,定义为前-前-S区,并发现该区之前存在一TA富集区,提示存在新型启动子的可能性。新界定的前-前-S区ORF编码氨基酸序列为MQLIITSKLGIIYILCGRLVFYIREKLHAVPHFVGHHILGNKSYS,与前-S1、前-S2和表面抗原主蛋白编码基因框架一致表达。结论:在HBV基因组中存在有一新的ORF,命名为前-前-S区。 | 董菁 成军 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，8： | 30 |
| 3 | 病毒性肝炎发病机制中的反式调节机制显示文摘病毒性肝炎的发病机制中涉及到复杂的反式调节(transregulation)机制.肝炎病毒的反式调节机制至少包括三方面的含义:一方面是肝炎病毒蛋白对于肝细胞基因组表达调节的反式调节,即肝炎病毒蛋白与肝细胞基因组启动子DNA结合,对于肝细胞基因表达谱产生影响;第二方面是肝细胞蛋白对于肝炎病毒基因表达的反式调节.肝炎病毒属于简单的生物类型,要完成其生活周期,必须借助于肝细胞中的蛋白成分,肝细胞中特有的一些蛋白成分,与肝炎病毒基因组DNA/RNA结合,对于肝炎病毒基因表达进行调节,这也是决定肝炎病毒嗜肝特性的重要的分子生物学机制;第三方面是肝炎病毒蛋白对于肝炎病毒基因组表达的反式调节.这是所有病毒复制和表达调节的一般机制.关于肝炎病毒反式调节机制的研究,主要是阐明肝炎病毒为何在肝细胞中的复制和表达处于最佳状态,阐明肝炎病毒的致病机制,有助于据此设计新型的抗肝炎病毒的治疗技术和治疗方法. | 成军 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，7： | 23 |
| 4 | 应用表达谱芯片技术对丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式调节基因的研究显示文摘目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式调节基因.方法:构建NS5A基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5A转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5A后,有54条差异基因表达,其中28条基因表达增强,26条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式调节基因,为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据. | 洪源 刘妍 成军 杨倩 王建军 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，7： | 22 |
| 5 | 慢性乙型肝炎的Th细胞亚群及相关细胞因子网络失衡显示文摘辅助性T细胞(helper T cell,Th细胞)是根据功能分类的一个T细胞亚群,根据所分泌细胞因子的不同,Th细胞可分为Th0、Th1、Th2和Th3 4种亚群,其中研究最多的是Th1和Th2两个亚群.Th1/Th2细胞及其细胞因子网络的调节对维持机体正常的免疫功能至关重要.乙型肝炎病毒(HBV)感染机体后,多种因素影响Th细胞增殖并且调节其亚型比例,细胞因子网络受到破坏,在细胞因子介导下便可造成肝脏等组织和器官的损害,直接或间接地影响到乙型肝炎发病及其转归. | 游晶 庄林 马永良 唐宝璋 | 2007 | 世界华人消化杂志2007，15，8： | 21 |
| 6 | 基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因显示文摘目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组编码的HBxAg是一种很强的反式激活(transactivation)病毒蛋白,在正常肝细胞的恶性转化(transformation)以及肝细胞癌(HCC)的形成过程中具有十分重要的作用.为了阐明HBxAg的表达对于肝细胞基因表达谱的影响,我们应用基因芯片技术,对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.方法:以含有全长乙型肝炎病毒基因的pCP10质粒作为模板,应用聚合酶链反应技术(PCR)扩增的HBxAg基因片段,常规分子生物学技术构建HBxAg的真核表达载体pcDNA3-HBxAg,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,HBxAg蛋白的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2中提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:经过限制性内切酶分析和序列测定,证实pcDNA3-HBxAg构建正确.HBxAg在HepG2细胞中的表达以Western blot杂交技术得到证实.对于HBxAg重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱,利用基因芯片技术进行分析.结果表明,16种基因的表达水平上调,58种基因的表达水平下调.这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导等基因,相信这些类型的基因在HBxAg的恶性转化中具有十分重要的作用.结论:HBxAg是一种病毒反式激活蛋白,对于肝细胞基因表达谱有显著影响;基因芯片技术是分析病毒反式激活蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径. | 成军 刘妍 洪源 王建军 杨倩 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，7： | 20 |
| 7 | 基因表达谱芯片技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白3反式调节靶基因显示文摘目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白3(non-structural protein 3,NS3)是由HCV基因组编码的具有多种功能的蛋白质.NS3蛋白的表达对于HCV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响.为了研究NS3蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-NS3分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析.方法:以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染hepG2细胞之后有NS3蛋白的表达,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有34个基因表达水平显著上调,37个基因表达水平显著下调.结论:HCV的NS3蛋白是一种反式激活因子.NS3基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径. | 成军 刘妍 洪源 王建军 杨倩 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，7： | 15 |
| 8 | 乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒反式调节靶基因的抑制性消减杂交和基因芯片分析结果的比较显示文摘目的:筛选与克隆HBV和HCV蛋白反式调节靶基因,阐明HBV和HCV感染后慢性肝脏疾病的发病机制.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及表达谱基因芯片(cDNAmicroarray)技术筛选并克隆HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因.以HBV和HCV蛋白的表达质粒转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.同时进行表达谱基因芯片技术分析.结果:成功构建人HBV和HCV蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,对HBV和HcV蛋白反式调节的靶基因同时进行基因表达谱芯片的分析.在SSH分析中,文库扩增后均得到200-800bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列.对于不同的肝炎病毒蛋白反式调节的靶基因类型,以及不同的分析技术研究的结果进行比较分析,发现了一系列的共同调节的靶基因,说明不同的肝炎病毒蛋白反式调节具有共同的作用途径.结论:筛选到的反式调节靶基因,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBV和HCV蛋白可能存在的调控机制,有助于阐明HBV和HCV蛋白的反式调节在慢性肝脏疾病的发生发展中的作用. | 成军 刘妍 洪源 王建军 杨倩 王琳 | 2004 | 世界华人消化杂志2004，12，2： | 14 |
| 9 | 乙型肝炎病毒基因组结构与功能复杂性的新认识显示文摘全世界有乙型肝炎病毒W(HBV)感染者3.5亿人。对于HBV多年的研究已经积累了丰富的资料,但是,我们对于HBV基因组特性的认识远远没有穷尽,事实上还有许多方面需要进行探索。通过对特定慢性HBV感染者血清中不同的HBV病毒基因克隆序列的比较提出了HBV准种特点,使我们对于HBV基因组结构与功能的复杂性有了更为深入的了解。野生型病毒之间、野生型病毒与突变型病毒之间、突变型病毒之间的反式调节机制是各种类型的缺陷型HBV存在的重要条件和机制,也是HBV感染引起肝细胞癌(HCC)的重要的分子生物学机制。外周血中存在羧基末端截短的表面抗原中蛋白(MHBs^t)的编码基因,使我们对于HBV基因编码的反式激活蛋白的类型有了新的认识。通过对克隆的HBVDNA全长基因序列的比较,以及与其他地域所流行的HBV DNA序列之间的比较,发现了新型的开放读码框架(ORF)如前-X(pre-X)蛋白的编码基因和前-前-S(per-pre-S)蛋白的编码基因。长距离精确聚合酶链反应(LA-PCR)技术克隆的HBV DNA全长序列,是我国流行的adr亚型的HBV DNA全基因序列,代表了真正存在的HBV的基因全长序列,在HBV基因结构与功能的研究中,以及在抗HBV治疗疗效应答的研究中具有重要的理论和实际应用价值。 | 成军 董菁 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，8： | 14 |
| 10 | 轮状病毒全身感染对肝胆胰的影响显示文摘目的:进一步了解轮状病毒(RV)全身扩散后对肝、胆、胰的影响,为指导临床的早期诊断与治疗提供有价值参考。方法:观察RV胃肠炎患儿肝、胆、胰损伤的临床表现和化验变化;采用光镜、电镜观察RV胃肠炎死亡患儿,人类RV感染小鼠模型的组织病理变化,采用原位PCR技术获取肝、胆、胰组织RV感染的直接证据。结果:RV胃肠炎患儿肝酶ALT、AST分别升高者占36.59%和78.05%,2项均显著升高者占7.32%;胰淀粉酶显著增高1例,胆指标均在正常范围内。光镜下RV胃肠炎死亡患儿肝细胞浊肿,明显脂肪变性,RV感染小鼠肝窦血管扩张充血、灶性坏死,汇管区和小叶内淋巴细胞、浆细胞浸润,胆道充血,胰腺无明显异常。电镜下RV感染小鼠肝细胞中存在大量脂滴和空泡,肝脏线粒体凝集病变明显,毛细胆管明显扩张,微绒毛脱落。原位PCR结果:RV胃肠炎死亡患儿肠、肝呈阳性,RV感染小鼠胆管上皮细胞和腺体,肝细胞膜、胞质以及枯否细胞胞质,胰腺细胞呈阳性显色。结论:人类RV一旦扩散至全身后,对肝、胆、胰可造成不同程度的损伤。 | 姚英民 李宁 欧巧群 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，6： | 12 |
| 11 | 羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究显示文摘目的:乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关。为深入研究HBV调节表达的机制,我们应用噬菌体展示技术,以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物,筛选肝细胞cDNA文库,获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN)。CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用。CPN是分子量280kD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83kD调节亚单位。核心启动子产生两个3.5kb RNA:前-核心和前基因组RNA。前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原,前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白,而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳,作为模板逆转录。前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用。核心启动子分为两部分:基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS),其上游为负性调节元件(NER,1616-1621nt)。CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚,我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体,通过脂质体转染NIH 3T3细胞,研究CPN对核心启动子的调节表达。方法:根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物,在核心启动子的引物两端引入MluⅠ和NheⅠ的酶切位点,在羧肽酶N的引物两端引入EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位点。用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因,克隆到pGEM-Teasy载体上。核心启动子经MluⅠ和NheⅠ双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上,羧肽酶N经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上,构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体,脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞。结果:HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206 bp和580 bp。重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功。脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加。通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达。结论:HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N(CPN)与HBV核心启动子共转染细胞,明显调节HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础。 | 张忠东 成军 钟彦伟 杨倩 王业东 董菁 杨艳杰 张树林 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，8： | 12 |
| 12 | 坚持相对稳定的科研方向是关键显示文摘发现、形成、坚持一个适合自己发展的相对固定的科研方向,是一个科学工作者必须面对的、至关重要的、影响全局的重要课题.选择适合自己发展的科研方向,首先要对所从事的学科专业的发展历史和现状有—个非常清楚的了解,还要选择对于学科发展具有重要意义的方向,也要适合自己科学研究的客观条件.对于国内外相对成功的科学家的课题选择特点进行分析,科研选题的风格有许多,典型的包括“守株待兔”型、“隧道挖掘”型.形成适合自己的科研方向还要排除一切形式的不必要的外部干扰.科研方向初步形成之后,要坚持相对固定的研究方向,要坚持、坚持、再坚持.科学工作需要有相应的科学思想、科学传统、科学氛围和科学文化的支持与衬托.提出并思考关于科学的科学,从更高的层次上认识思考,对于我国的科学事业将是一个重要的推动. | 成军 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，12： | 12 |
| 13 | 乙型肝炎病毒中国流行株全基因的克隆与序列分析显示文摘目的:从中国慢性乙型肝炎患者的血清中,应用长距离多聚酶链反应技术(L-PCR)技术扩增、克隆乙型肝炎病毒(HBV)的全基因组序列,建立中国HBV流行株的参考标准序列。方法:从2例慢性乙型病毒性肝炎患者血清提取DNA,以L-PCR技术对于3 200 bp的HBV DNA进行扩增,纯化后克隆到TA载体中进行序列分析。对于HBV DNA的各个编码基因区进行分析。结果:克隆获得的5个HBV DNA全基因序列分别为G376-A6、G376-A7、G683-A1、G683-A2和G683-A3,全基因序列长度分别为3 125、3 215、3 213、3 182和3 215碱基对(bp),在GenBank中的注册号分别为AF384372、AF384371、AF363963、AF363962和AF363961。其中G376-A6、G376-A7来源于同一个患者,G683-A1、G683-A2、G683-A3来源于另一个患者。G376-A6、G683-A2两株病毒在前-S1区存在缺失突变区。其中G683-A2的羧基末端区存在缺失突变。来源于不同患者的e/核心抗原蛋白质一级结构序列没有显著的差别,但来源于同一个患者的HBV基因序列有着明显的同源性。G376-A6、G683-A2两株病毒存在多聚酶蛋白区的缺失突变,但不在多聚酶蛋白的活性结构区,因此考虑这种形式的突变尚不会影响到多聚酶的活性。G683-A3株病毒的多聚酶在其羧基末端存在较长的缺失突变区,使其多聚酶区结构被破坏。5株病毒的X蛋白的一级结构序列比较的结果说明其高度保守。但是相对来讲,X蛋白的氨基末端更为保守,羧基末端序列有一定程度的变异。结论:克隆了HBV DNA中国株的全基因序列,可以作为研究中HBV流行株的参考序列。 | 成军 董菁 洪源 钟彦伟 刘妍 王刚 王琳 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，8： | 12 |
| 14 | 丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6上调新生多肽相关复合物α多肽基因的表达显示文摘目的:探讨HCV核心蛋白结合蛋白6对新生多肽相关复合物α多肽启动子的激活作用.方法:以基因表达谱芯片技术筛选HCBP6表达质粒转染HepG2细胞后的差异表达基因为基础,利用生物信息学技术确定NACA的启动子区域(NACA-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NACA-p,克隆至真核表达载体pCAT3中,构建pCAT3-NACA-p表达载体;以该质粒转染COS-7、NIH3T3细胞系,用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;与pcDNA3.1(-)-HCBP6共转染NIH 3T3细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:质粒pCAT3-NACA-p在NIH 3T3、COS-7细胞中能够激活CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NACA-p+pcDNA3.1(-)-HCBP6组CAT的表达活性是pCAT3-NACA-p的4倍.结论:pCAT3-NACA-p具有启动子活性;HCV核心蛋白结合蛋白6对NACA-p有激活作用.本研究为探讨HCV核心蛋白结合蛋白6的功能提供新的实验及理论基础. | 杨倩 刘妍 成军 李克 王建军 洪源 张树林 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，7： | 11 |
| 15 | 丙型肝炎病毒核心蛋白上调细胞周期调节蛋白Weel基封表达研究显示文摘目的:了解丙型肝炎病毒核心蛋白和细胞周期调节蛋白Weel基因表达的关系,研究HCV核心蛋白在HCV致病的分子生物学机制中的作用.方法:应用聚合酶链反应(PCR)扩增Weel基因启动子,命名为Weep.以T-A克隆法,将Weep基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pT-Weep,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnI和XhoI双酶切后构建Weel启动子报告载体pCAT3-Weep,分别以重组报告载体pCAT3-Weep和pcDNA3.1(-)-core瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3basic的HepG2细胞为阴性对照,48h后收获细胞.应用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解HCV核心蛋白对Weel基因启动子的反式激活作用.结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-core和报告载体pCAT3-Weep经过序列分析和酶切鉴定正确.pCAT3-Weep和pcDNA3.1(-)-core瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3空载体的3.4倍,pCAT3-Weep的2.3倍.结论:丙型肝炎病毒核心蛋白可反式激活Weel基因启动子,进而上调细胞周期调节基因Weel的表达。 | 王建军 刘妍 成军 杨倩 杨艳杰 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，7： | 10 |
| 16 | 乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因10的克隆化研究显示文摘目的:乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HBxAg蛋白反式激活作用新的靶基因,利用基因芯片技术(DNA chips)对于表达和不表达HBxAg的hepG2细胞的基因表达谱进行比较,以期发现HBxAg蛋白反式激活作用的新靶点,为阐明HBxAg的反式激活作用分子生物学机制,以及HBV相关的肝细胞癌(HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向.方法:以含有2拷贝头尾连接的HBV DNA的质粒pCP10作为模板,根据ayw亚型的HBV DNA序列设计、合成引物,PCR扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,转染肝母细胞瘤细胞系hepG2,提取RNA并进行逆转录.进行基因芯片技术分析.以生物信息学技术,克隆、鉴定新基因.结果:在16种HBxAg上调的靶基因中,其中包括未知功能基因,利用生物信息学技术,获得HBxAg蛋白反式激活作用的新型靶基因,开放读码框架(ORF)长度为1 206个核苷酸(nt),编码产物由401个氨基酸残基(aa)组成,命名为XTP10.结论HBxAg是一种具有反式激活作用的蛋白.基因芯片技术是进行基因表达谱分析的可靠、有效技术.分子克隆技术结合生物信息学技术,是目前鉴定、克隆未知功能新基因的有效技术途径. | 成军 刘妍 洪源 王琳 钟彦伟 董菁 王刚 | 2003 | 世界华人消化杂志2003，11，7： | 9 |
| 17 | 应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活的相关基因显示文摘目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建乙型肝炎病毒 (HBV)前 S1蛋白 (pre S1)反式激活的相关基因cDNA消减文库 ,克隆前 S1反式激活相关基因 ,以期发现前 S1蛋白反式激活作用的靶位点 ,为阐明前 S1蛋白的反式激活作用的分子生物学机制 ,以及HBV相关肝细胞癌 (HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向。方法 以HBV前 S1表达质粒pcDNA3 .1(-) preS1转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaⅠ酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与pGEM Teasy载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌DH5α进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到 67个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 5 1个 2 0 0~ 10 0 0bp插入片段。对所得片段测序 ,并进行同源性分析 ,获得 3 2种编码基因 ,其中 2 6个为已知功能基因 ,另外 6个为未知功能序列 ,可能是前 S1蛋白反式激活新的靶基因。结论 成功构建HBV前 S1反式激活的相关基因cDNA消减文库 ,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。为进一步阐明前 | 纪冬 成军 王建军 董菁 郭江 刘妍 杨倩 党晓燕 王春花 | 2004 | 胃肠病学和肝病学杂志2004，13，1： | 9 |
| 18 | 乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒对肝细胞信号转导的影响显示文摘乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染肝细胞之后,肝炎病毒蛋白的表达对与肝细胞中正常的信号转导通路产生显著的影响.肝炎病毒蛋白对于肝细胞信号转导的影响,势必影响肝细胞的细胞周期、细胞凋亡、细胞生长以及细胞的恶性转化等环节.因为这些细胞的基本的生命活动现象,都与细胞正常的信号转导有关.肝炎病毒蛋白对肝细胞信号调节的影响,一方面通过蛋白一蛋白之间的相互作用而实现,另一方面也通过对肝细胞基因表达谱的影响而实现.因此,利用现代分子生物学技术,对肝炎病毒蛋白结合的蛋白基因进行研究,利用基因差异表达技术对肝炎病毒蛋白反式调节的靶基因进行筛选,阐明肝炎病毒蛋白表达时,能够上调和下调的靶基因类型,对于深入研究肝细胞获得肝炎病毒基因表达之后信号转导途径具有十分重要的意义.中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心,在内科传染病学专业博士生导师、生物化学与分子生物学专业博士生导师成军博士、教授、主任医师的领导下,建立了筛选肝炎病毒调节基因结合蛋白的酵母单杂交技术,筛选肝炎病毒蛋白、肝细胞蛋白的结合蛋白的酵母双杂交技术,筛选肝炎病毒蛋白反式调节肝细胞基因的抑制性消减杂交和表达谱基因芯片研究技术等,系统研究肝炎病毒与肝细胞相互作用的分子生物学机制,并有新的发现.本专题研究中所发表的这些重要文章,对于进一步深入探索和研究肝炎病毒对肝细胞正常信号转导的影响,将产生重要推动作用. | 成军 | 2004 | 世界华人消化杂志2004，12，2： | 9 |
| 19 | 病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略显示文摘乙型肝炎病毒 (HBV)和丙型肝炎病毒 (HCV)感染引起病毒性肝炎的发病机制目前还有许多方面没有研究清楚。以肝炎病毒相关的新基因克隆化为主要目的的研究是病毒性肝炎发病机制研究领域中创新知识的重要源泉。病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节 ,肝炎病毒基因编码的蛋白与肝细胞中的蛋白能够结合 ,这种相互作用对于肝细胞正常的信号转导过程产生显著影响 ,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响 ,也可能是病毒性肝炎、肝细胞癌 (HCC)发病机制中的主要机制。酵母单杂交技术、酵母双杂交技术、基因芯片技术、抑制性消减杂交技术、噬菌体展示技术、蛋白质分离纯化与基因克隆化的反向遗传学技术等 ,在肝炎病毒基因调控、肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究、肝炎病毒蛋白反式激活靶基因的研究中都有重要的应用 ,是促进慢性病毒性肝炎发病机制研究、探索病毒性肝炎新型治疗技术和治疗方法的有效途径和手段。 | 成军 | 2003 | 解放军医学杂志2003，28，9： | 8 |
| 20 | 实时荧光定量检测HCV RNA含量的临床意义显示文摘目的:建立实时荧光定量RT-PCR(RFQ-RT-PCR)检测HCV RNA含量的方法,初步探讨HCV RNA含量变化与病情的相关性. 方法:HCV抗体阳性样本80例,包括慢性肝炎(CH) 39例,肝硬化(LC)23例,肝癌(HCC)18例,献血员样本40例为正常对照.在HCV基因组5’非编码区(5’UTR)设计特异性引物和一对杂交探针,构建相应基因片段载体,体外转录RNA作为标准品,根据其建立的标准曲线对血清HCV RNA进行定量,同时用传统的套式RT-PCR进行定性分析. 结果:本法检测HCV RNA含量的线性范围为1012-104copies/L,批内和批间重复性测定的v分别为1.68-5.97%和6.40-10.58%.在HCV抗体阳性患者中, 肝硬化和肝癌患者的HCV RNA含量显著高于慢性肝炎患者(7.75±0.29,7.86±0.32 vs 4.67±0.41,P<0.05), 而且HCV RNA含量与ALT水平呈正相关(r=0.89, t=8.29,P<0.05). 结论:RFQ-RT-PCR检测HCV RNA含量具有较好的灵敏度和特异性,其含量与丙型肝炎患者的病情变化及严重程度有一定相关性. | 张冬雷 施健 崔之础 王惠民 鞠少卿 李立人 倪红兵 苏建友 | 2005 | 世界华人消化杂志2005，13，1： | 8 |
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