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| 1 | 应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活的相关基因显示文摘目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建乙型肝炎病毒 (HBV)前 S1蛋白 (pre S1)反式激活的相关基因cDNA消减文库 ,克隆前 S1反式激活相关基因 ,以期发现前 S1蛋白反式激活作用的靶位点 ,为阐明前 S1蛋白的反式激活作用的分子生物学机制 ,以及HBV相关肝细胞癌 (HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向。方法 以HBV前 S1表达质粒pcDNA3 .1(-) preS1转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaⅠ酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与pGEM Teasy载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌DH5α进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到 67个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 5 1个 2 0 0~ 10 0 0bp插入片段。对所得片段测序 ,并进行同源性分析 ,获得 3 2种编码基因 ,其中 2 6个为已知功能基因 ,另外 6个为未知功能序列 ,可能是前 S1蛋白反式激活新的靶基因。结论 成功构建HBV前 S1反式激活的相关基因cDNA消减文库 ,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。为进一步阐明前 | 纪冬 成军 王建军 董菁 郭江 刘妍 杨倩 党晓燕 王春花 | 2004 | 胃肠病学和肝病学杂志2004，13，1： | 9 |
| 2 | SSH与cDNA芯片技术的联合及其在植物基因差异表达研究中的应用显示文摘抑制消减杂交技术(SSH)与cDNA芯片技术是新近发展起来的研究差异表达基因的两种非常有效的方法。近年来,将SSH和cDNA芯片技术结合使用,为分析组织细胞的已知基因表达差异提供了新的手段,也为克隆和鉴定新基因开辟了新的道路,是目前寻找差异表达基因的适用方法。鉴于此,对SSH和cDNA芯片技术的基本原理、两种方法结合使用的操作流程、克隆差异表达新基因的特点,以及在植物基因差异表达方面的应用进行了概述。 | 康俊梅 孙彦 杨青川 | 2007 | 中国草地学报2007，29，5： | 4 |
| 3 | 福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良早期生长板消减cDNA文库的构建显示文摘【目的】为应用cDNA芯片技术筛选肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)时序性差异表达基因,本研究构建了早期生长板消减cDNA文库。【方法】将7日龄AV肉鸡随机分为两组,对照组(control,C)饲以基础日粮,试验组(thiram diet-fed,T)饲以基础日粮添加福美双100 mg·kg-1,2 d后继续饲以基础日粮,诱发肉鸡TD。应用抑制消减杂交技术(SSH)构建正反向消减cDNA文库,用PCR验证两个文库中克隆的插入片段,随机抽取100个阳性克隆测序,对所测序列同源性分析和功能预测。【结果】从两个文库共获得2 227个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在200—1 000bp之间;所测序列中有97条ESTs与GenBank中的鸡基因序列同源性达到99%,且非冗余度达到68.7%;此外,有3条ESTs未找到同源序列。这些基因具有构成细胞外基质,参与软骨内骨化和骨的重构,调节骨发育,行使信号转导、血管发生,参与电子传递及能量代谢等功能。【结论】成功构建了消减cDNA文库,将为进一步点制cDNA芯片,筛选不同阶段的差异表达基因奠定了基础,也为肉鸡TD机理研究提供新线索。 | 宁官保 田文霞 王瑞 覃平 乔建钢 李宏全 李家奎 毕丁仁 潘思轶 郭定宗 | 2011 | 中国农业科学2011，44，4： | 3 |
| 4 | 应用基因表达谱芯片技术筛选HBV前-S2蛋白反式调节基因显示文摘目的:乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白是由HBV S基因编码的具有多种功能的蛋白质.前-S2蛋白的表达对于HBV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响.为了研究前-S2蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1 (-)和pcDNA3.1(-)-preS2分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析. 方法:以含有HBV全基因组的质粒G376-7(GenBank号: AF384371)作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增前-S2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-preS2.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较. 结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA事列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有42个基因表达水平显著上调,36个基因表达水平显著下调. 结论:HBV的前-S2蛋白是一种反式激活因子,前-S2基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响. | 纪冬 成军 董菁 刘妍 王建军 郭江 | 2004 | 世界华人消化杂志2004，12，7： | 3 |
| 5 | 应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因1的反式调节基因显示文摘目的:筛选与克隆丙型肝炎病毒(HCV)NS3反式激活基因1 的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索. 方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin- formatics),技术筛选并克隆NS3TP1反式激活的新型靶基因. 以NS3TP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后, 将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人NS3TP1反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR 分析,均得到200-1000 bp插入片段.随机挑选其中36个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得23种编码基因,其中3个为未知功能的新基因. 结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因, 推测了NS3TP1可能存在的调控机制的线索. | 纪冬 成军 王建军 刘妍 杨倩 党晓燕 王春花 | 2004 | 世界华人消化杂志2004，12，4： | 2 |
| 6 | 应用基因表达谱芯片技术筛选NS3TP1转染细胞差异表达基因显示文摘目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活基因1(NS3TP1)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步NS3TP1蛋白可能的分子生物学功能. 方法:设计并合成NS3TP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3TP1蛋白编码基因片段, 以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)- NS3TP1.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较. 结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有26个基因表达水平显著上调,14个基因表达水平显著下调. 结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS3TP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS3TP1蛋白可能的生物学功能及HCV的致病机制提供理论依据. | 纪冬 成军 刘妍 王建军 郭江 | 2004 | 世界华人消化杂志2004，12，7： | 1 |
| 7 | 应用基因表达谱芯片技术筛选XTP6基因转染细胞差异表达基因显示文摘目的 应用基因芯片技术 ,检测乙型肝炎病毒 (HBV)X蛋白 (HBxAg)反式激活基因XTP6的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响 ,进一步阐明XTP6蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP6基因序列特异性的引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增XTP6基因片段 ,以常规的分子生物学技术将获得的XTP6编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 .1(-) XTP6。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取mRNA ,逆转录为cDNA ,与转染空表达载体pcDNA3 .1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析的DNA序列测定 ,证实准确无误。提取高质量的mRNA ,逆转录为cDNA ,进行cDNA芯片分析。在 115 2个基因表达谱的筛选中 ,发现 2 1个基因表达水平显著上调 ,18个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP6转染细胞后差异表达基因 ,为进一步阐明XTP6蛋白可能的生物学功能提供依据。 | 纪冬 成军 郭江 杨瑗 董菁 王建军 刘妍 | 2005 | 胃肠病学和肝病学杂志2005，14，1： | 1 |
| 8 | 应用微阵列技术筛选PS1TP1基因转染细胞差异表达基因显示文摘阐明乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白反式激活蛋白1(PS1TP1)的表达对于肝细胞的基因表达谱的影响。应用基因芯片技术对于pcDNA3.1()和pcDNA3.1()PS1TP1分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析。以肝癌细胞系HepG2基因作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增PS1TP1基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1()PS1TP1。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1()的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。在4096个基因表达谱的筛选中,发现有8个基因表达水平显著上调,14个基因表达水平显著下调。PS1TP1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径。 | 纪冬 成军 郭江 刘妍 王琳 郭风劲 | 2005 | 中国病毒学2005，20，3： | 1 |
| 9 | 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A上调硫氧还蛋白还原酶1基因表达的研究显示文摘目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用。方法以我室构建的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3_Basic中,构建pCAT3_TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)_NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果pCAT3_TXNRD1p和pcDNA3.1(-)_NS5A瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3_Basic空载体的9.6倍,pCAT3_TXNRD1p的2.1倍。本实验进一步验证了我室利用SSH技术及基因表达谱技术发现的HCVNS5A蛋白反式激活TXNRDl基因转录作用的结果。结论我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS5A蛋白具有对TXNRD1基因启动子的反式激活作用。 | 纪冬 成军 郭江 杨瑗 董菁 王建军 刘妍 | 2005 | 胃肠病学和肝病学杂志2005，14，4： | 0 |
| 10 | 诱导型一氧化氮合酶基因启动子在不同细胞系中的转录活性显示文摘目的:探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子在不同细胞系中转录活性的差别. 方法:利用生物信息学技术确定iNOS基因的启动子区域(iNOSp),聚合酶链反应(PCR)扩增iNOSp,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-iNOSp报告载体;以该质粒分别转染正常人肝细胞株LO2,人肝母细胞瘤细胞系HepG2,小鼠成纤维细胞NIH-3T3, 人贮脂细胞(Lipocyte Ito Cell)和肝癌细胞株SMMC- 7721,用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)在不同细胞系中的表达活性. 结果:成功获得iNOS基因启动子的正确克隆,克隆的iNOS启动子有顺式激活下游基因的活性.pCAT3- iNOSp瞬时转染HepG2细胞的CAT表达活性最强,肝贮脂细胞Ito中CAT表达活性最弱. 结论:不同细胞中iNOS启动子的表达活性不同,其表达活性与细胞类型与细胞状态密切相关. | 郭风劲 成军 纪冬 刘妍 王琳 张黎颖 戴久增 宋方洲 | 2005 | 世界华人消化杂志2005，13，4： | 0 |
| 11 | 应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的下调基因显示文摘目的筛选与克隆乙型肝炎表面抗原大蛋白(LHBs)的下调基因,以阐明HBV感染相关性疾病的分子生物学机制。方法应用常规分子生物学方法,克隆LHBs基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-LHBs。将 pcDNA3.1(-)-LHBs与pCAT3-promoter共转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。分别以pcDNA3.1(-)-LHBs以及pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞,提取mRNA并逆转录为cDNA,来源于pcDNA3.1(-)-LHBs转染细胞的cDNA为驱动(driver),来源于pcDNA3.1(-)的cDNA为测试(tester),进行抑制性消减杂交分析,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆进行测序及同源性分析。结果①成功构建pcDNA3.1(-)-LHBs真核表达载体;②pcDNA3.1(-)-LHBs与pCAT3-promoter共转染HeoG2细胞的CAT 表达活性较对照组的活性明显下降(P<0.01),抑制率达93.9%;③成功构建人LHBs下调基因的cDNA消减文库。通过生物信息学分析获得14种编码基因。结论 LHBs是HBV基因组编码的一种反式调节因子,可以下调SV40 早期启动子的活性。筛选到的LHBs下调的cDNA全长序列,包括与抗氧化防御、细胞生长调节、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,以此可以推测LHBs存在的调控机制以及HBV的致病(癌)机制。 | 纪冬 成军 郭江 刘妍 陈国凤 王琳 | 2005 | 中华老年多器官疾病杂志2005，4，4： | 0 |
| 12 | HCV p7蛋白反式调节新基因3及其剪切体克隆化和生物信息学分析显示文摘目的:筛选HCV p7病毒蛋白反式调节的新靶基因p7TP3,克隆p7TP3基因及其不同剪切体基因序列,并进行功能分析,探讨丙型肝炎病毒(HCV)p7病毒蛋白在HCV致病过程中的作用.方法:依据我们构建的真核表达载体pcDNA 3.1(-)-p7转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行基因表达谱芯片分析,利用生物信息学技术获得新基因 p7TP3及其可变剪切体的编码序列,设计特异性引物,并对其进行克隆化研究. 结果:经测序鉴定获得新基因p7TP3的编码序列,并发现了p7TP3的不同剪切体,对 D7TP3基因组进行分析,获得剪切体的编码序列,并进行了克隆化研究及生物信息学分析.p7TP3(416 bp)编码蛋白质序列比 p7TP3(477 bp)少TQNTDVYPGLAVFFQNAL IFFSTLIY 26个氨基酸残基,其余序列相同.结论:HCV p7蛋白是一种典型的病毒基因组编码的具有反式调节作用的蛋白.利用分子生物学技术与生物信息学分析,发现并鉴定了HCV p7TP3反式调节作用的新的靶基因 p7TP3及其剪切体,为阐明HCV p7蛋白的反式调节作用及其机制开辟了新的研究方向. | 陶明亮 成军 王春花 郭江 袁菊 靳亚平 毛羽 | 2006 | 世界华人消化杂志2006，14，6： | 0 |
| 13 | 应用基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒HBsAg基因转染细胞差异表达基因显示文摘目的 应用基因表达谱芯片技术研究乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)主蛋白的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响。方法 设计并合成HBsAg主蛋白基因序列特异性的引物 ,以含有HBV全基因组的质粒G3 76A7作为模板 ,应用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增HBsAg蛋白编码基因片段 ,以常规的分子生物学技术构建表达栽体pcDNA3 1(-)_HBsAg。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取总mRNA ,逆转录为cDNA ,与转染空白表达载体pcDNA3 1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果 在 115 2个基因表达谱的筛选中 ,发现有 3 0个基因表达水平显著上调 ,2 9个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了HBsAg转染细胞后差异表达的基因 ,为深入研究HBsAg可能的生物学功能提供依据。 | 纪冬 成军 董菁 刘妍 王建军 郭江 | 2005 | 胃肠病学和肝病学杂志2005，14，1： | 0 |
| 14 | 乙型肝炎病毒全S蛋白反式激活蛋白1基因的克隆化显示文摘目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin formatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)全S反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制. 方法:以HBV全S蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-全S转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,与对照组cDNA进行二次杂交和二次PCR.并结合生物信息学技术,克隆HBV 全S反式激活作用的新型靶基因. 结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.成功克隆出他的全长序列并测序证实,其可以被全S蛋白反式激活,故命名为全S反式激活蛋白1 (CSTP1),已在GenBank中注册,注册号:AY553877.CSTP1 基因的编码序列全长为945个核苷酸(nt),编码产物由315 个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HBV全S蛋白具有反式激活蛋白1基因克隆成功. HBV全S反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HBV全S的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础. | 白桂芹 成军 刘妍 吴顺华 蔺淑梅 黄燕萍 张树林 | 2004 | 世界华人消化杂志2004，12，11： | 0 |
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