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| 1 | 双峰驼FCGRT基因的原核表达及多克隆抗体的制备显示文摘为制备抗双峰驼FcRn的抗体,首先从NCBI收录的双峰驼FCGRT基因序列中选取编码区,经跨膜结构和信号肽预测分析,截取不含信号肽的膜外序列并构建重组质粒pET-28a-FcRn,然后在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达及表达条件优化,用纯化后的FcRn重组蛋白免疫家兔,制备抗双峰驼FcRn的多克隆抗体,并通过间接ELISA和Western blot检测效价及其特异性。结果表明,获得的FcRn重组蛋白与预期大小一致(34 ku),且以包涵体形式表达,其最佳IPTG诱导浓度为0.3 mmol/L,诱导时间为6 h。ELISA检测抗体效价为1∶32000,Western blot鉴定该抗体能与重组蛋白发生特异性结合。说明已成功制备了高效价和特异性良好的兔抗双峰驼FcRn多克隆抗体。 | 刘丽萍 火兴民 谢飞 张旺东 吴秀萍 李瑞 陆佳 王雯慧 | 2021 | 动物医学进展2021，42，4： | 5 |
| 2 | 双峰驼Cyp-A的原核表达及多克隆抗体制备显示文摘【目的】制备双峰驼亲环素A(cyclophylin A,Cyp-A)的多克隆抗体,为揭示双峰驼体内的黏膜免疫反应机理提供依据。【方法】从GenBank数据库中双峰驼Cyp-A基因序列(登录号:XM_010969543.1)上选取编码区,截取不含信号肽的膜外序列进行碱基优化后,与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒pET-28a-Cyp-A。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达并对表达条件进行优化,优化诱导条件后通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。纯化重组蛋白并免疫家兔,制备兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体,分别使用ELISA和Western blotting检测抗体效价及特异性,并采用HE和SABC免疫组化染色法对Cyp-A多克隆抗体进行定位观察。【结果】重组质粒pET-28a-Cyp-A主要以包涵体形式表达,Cyp-A蛋白约为17 ku,最佳诱导条件为0.7 mmol/L IPTG诱导8 h,杂蛋白最佳洗脱液为5 mmol/L咪唑。经ELISA和Western blotting检测,兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体的效价为1∶64000,能特异性识别重组蛋白Cyp-A。经HE和SABC免疫组化染色观察,Cyp-A多克隆抗体仅能使回肠滤泡相关上皮(FAE)中的M细胞特异性着色。【结论】试验成功制备出效价高、特异性强的兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体,能特异性识别双峰驼回肠中M细胞。 | 索南吉 李沛轩 刘转霞 王亭玮 刘柯江 谢东旭 曾巍巍 王雯慧 | 2023 | 中国畜牧兽医2023，50，7： | 0 |
| 3 | 双峰驼GP2的原核表达、抗体制备及其在回肠中的表达显示文摘糖蛋白2(glycoprotein 2,GP2)是由粘液腺和分泌细胞产生的一种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins,GPI-APs),能够摄取肠腔内的病原菌,对维持机体的稳态具有重要意义。为获得抗双峰驼(Camelus bactrianus)GP2的抗体并研究GP2在双峰驼回肠中的表达情况,将双峰驼GP2基因(GenBank No.XM_045521202.1)连接至pET-28a,构建重组质粒p ET-28a-GP2,再转入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21(DE3)中诱导表达,优化诱导条件后,通过SDS-PAGE和Western blot验证。用已获得目的蛋白制备兔抗双峰驼GP2多克隆抗体,并通过ELISA和Western blot检测效价及其特异性,最后采用免疫组织化学染色方法了解其在回肠中的表达情况。结果表明,GP2蛋白的大小约为65 kD,最佳诱导条件为0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)6 h,主要以包涵体的形式表达。经ELISA和Western blot检测,抗体效价为1∶2.56×10^(5),能特异性识别重组蛋白GP2。免疫组织化学染色结果显示,GP2主要在回肠的滤泡相关上皮表达,并且在微皱褶细胞的细胞膜上表达。本研究为GP2的后续研究提供了参考,同时丰富了黏膜免疫的相关理论,解决了目前市场上没有商品化抗体的问题,为开发新型药物提供抗体支撑。 | 刘柯江 李沛轩 张睿 王亭玮 索南吉 王雯慧 | 2023 | 农业生物技术学报2023，31，8： | 0 |
| 4 | 双峰驼TLR7的原核表达及其多克隆抗体制备显示文摘Toll样受体7(TLR7)可介导机体抗病毒等免疫应答,是重要的胞内模式识别受体之一。为获取双峰驼TLR7多克隆抗体,从双峰驼TLR7序列(GenBank Accession:XM_010966214.1)选取编码区,经过跨膜结构与信号肽分析,取膜外序列构建重组质粒pET-28a-TLR7,并转化进感受态细胞BL21(DE3)中,对IPTG诱导表达的蛋白进行纯化及SDS-PAGE鉴定,将纯化蛋白免疫家兔,制备兔抗双峰驼重组TLR7多克隆抗体,并进行间接ELISA和Western blot检测分析。结果:诱导表达的重组双峰驼TLR7约为47 kDa,与预期大小一致,IPTG最佳诱导浓度为0.3 mol/L,最佳诱导时间为6 h,以包涵体形式表达;间接ELISA检测显示,制备的兔抗重组双峰驼TLR7多克隆抗体效价为1∶32 000,经Western blot鉴定可知抗体特异性良好;在成年双峰驼的空肠淋巴结中检测验证TLR7,根据SABC免疫组化试验得到该抗体的最佳工作浓度为1∶800,并通过光学显微镜观察到TLR7在淋巴结的副皮质区的树突状细胞中表达,证明本试验已制备出高效价和特异性较好的兔抗重组双峰驼TLR7的多克隆抗体。重组双峰驼TLR7的成功表达及其多克隆抗体的制备,为进一步研究双峰驼体液免疫及抗感染治疗奠定了基础。 | 刘静宇 李沛轩 刘转霞 张睿 陆佳 张旺东 王雯慧 | 2023 | 畜牧与兽医2023，55，1： | 0 |
| 5 | 双峰驼TLR5抗体制备及其在淋巴结中的表达显示文摘【目的】制备兔抗双峰驼Toll样受体5(TLR5)的多克隆抗体并鉴定其活性。【方法】选择双峰驼TLR5基因序列,经软件分析选择其编码区的膜外区1~499氨基酸位为主要抗原位,再选取对应的核苷酸序列进行基因合成,并与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒pET28a-TLR5,对其进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。将pET28a-TLR5转染大肠杆菌原核表达系统,用IPTG进行诱导表达,对IPTG浓度(0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mol/L)和诱导时间(2,3,4,5,6,7,8,9 h)进行优化。将表达的蛋白经亲和层析法纯化后免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体,采用ELISA法检测多抗效价,用Western blot检测和免疫组化验证评价多克隆抗体的特异性。【结果】成功构建了重组质粒pET28a-TLR5,经IPTG诱导后获得了重组蛋白(大小约为57 ku),且以包涵体的形式表达。IPTG最佳诱导表达条件为:IPTG浓度为1 mol/L,诱导时间为6 h。TLR5多抗血清效价为1∶128000。Western blot鉴定表明,TLR5多抗血清能特异性识别目的蛋白;免疫组化结果表明,TLR5多抗能很好地识别成年双峰驼十二指肠肠系膜淋巴中的TLR5阳性细胞。【结论】成功制备出特异性良好的兔抗双峰驼TLR5多克隆抗体,能够用于TLR5的检测。 | 王亭玮 刘转霞 陆佳 李沛轩 刘柯江 曾巍巍 索南吉 谢东旭 王雯慧 | 2023 | 西北农林科技大学学报(自然科学版)2023，51，12： | 0 |
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